微生物生長曲線 &
連續稀釋塗抹平板法 & 總生菌數測定
<實驗目的>
1. 學習分光光度計的測定原理和實驗步驟
2. 瞭解微生物生長曲線的四個時期所代表的意義
3. 了解微生物生長情形,生理特性與培養特徵
4. 細菌在培養液中生長速率及生長曲線繪製及計算
<細菌生長曲線>
以菌數和時間作圖在批次培養情形下,
可以菌數和時間作圖,得生長曲線。
微生物在封閉的環境中的生長情形,
隨著營養物的消耗、 代謝物的產生等交互作用,
微生物的族群密度隨時間所呈現出來的曲線,
就是微生物的生長曲線。
受到外界環境因子生長,細菌數目增倍所需的時間不同,
且因菌種不同而有差別,
因此計算研究細菌生理作用或細菌與其他生物作用時,
常需使用定量的細菌數,因此必須明白每個菌株的生長速率,
而繪製及計算兩生長曲線：
時間與細菌數目的生長曲線
及吸光值 (OD)與細菌數目的生長曲線。
進而利用吸光值與時間的生長曲線是否成直線相關,
作為評估實驗的誤差。
細菌在培養液中生長情形可分四種時期:
(1)遲滯期 (lag phase)
當細菌加入新的營養液中,為適應新環境要表現新的基因,
以便從環境中獲得營養成分進行複製,細胞雖變大,
但仍未分裂, 故細胞數目無明顯增加;
在這階段細菌數目並未增加,所以稱為遲滯期。
(2)對數期 (logarithmic phase)
細胞呈幾何級數增加,菌之生理較一致,
為微生物實驗最佳時期。
(3)靜止期或穏定期 (stationary phase)
當環境中養分因細菌攝取而減少,
微生物代謝,消耗養分、同時產生代謝毒物,
造成新分裂與死亡之菌數約略相等,
使得細菌無法進行正常複製,
同時也改變基因的表現,細菌數目不再增加,
此階段稱為靜止期。
(4)減數期或死滅期 (reduction phase)
養分已漸消耗完畢,而代謝毒物累積更多,
細菌逐漸老化而死亡時,活細菌數目逐漸降低,
造成新生菌數遠小於死亡菌數,時間愈久活菌數目愈少,
因此菌數遞減,此階段稱為減數期。
而測定細菌的生長區線主要有：
直接計數法、平板計數法、混濁度計算法。
直接計數法：由顯微鏡下計算細菌數。
平板計數法：將菌液連續稀釋,將稀釋後的各個濃度菌液取一定量
塗抹在平板培養基上培養,計算培養基上的菌落數,
來推算原菌液的細菌數。
混濁度計算法：利用分光光度計,
波長 590-600 nm 的可見光來測量菌液的混濁度,
通常以 OD 600來測量。
OD 600超過 0.9 以上時,將菌液稀釋 10 倍後再測定,
值需乘以 10 才是正確的混濁度。
實驗 一 :
微生物生長曲線
<試劑及材料>
維生素C培養液 /大腸桿菌Escherichia Coli
<實驗步驟>
1.取少許大腸桿菌與培養液搖均勻
2.取部份菌液加入比色管 (1cc),用分光光度計測其吸光質
3.將菌液瓶放在 37℃的培養箱振盪培養,
每 30分測一次吸收,共測四次
先以維生素 C 培養液當 blank
取 0.3cc大腸桿菌液與至10cc的培養液試管中
加完後搖均勻
取部份菌液加入比色管 (1cc),用分光光度計測其吸光值
蓋子蓋起來更準確
先按 blank 歸零
開啟分光光度計 →加入定量菌至玻璃測管
→將玻璃測管至於測量位置 →紀錄 OD 600數值
第一次 ( 0分鐘) 吸光值為 0.126 (以第一次為 blank)
水浴振盪器 (Water Bath Shaker)
以水浴保持溫度恆定,
再加上振盪裝置,用於需氧菌之液體培養
將菌液瓶放在 37℃的培養箱振盪培養,
每 30分鐘取出瓶子,測其吸光值
(取部份菌液每 30分測一次吸收,共測四次)
之所以放在 37℃的培養箱中,
是因為它為大腸桿菌的適合溫度!
每次測之前先用 blank 歸零,
將放在振盪培養箱的菌液瓶取出,取部份菌份,測其吸光值
第二次 (30分) 吸光值為 0.198
第三次 (60分) 吸光值為 0.338
第四次 (90分) 吸光值為 0.368
第五次 (120分) 吸光值為 0.434
<實驗結果>
時間與吸光值紀錄表:
|
時間(分鐘) |
0 |
30 |
60 |
90(T1) |
120(T2) |
|
吸光度值 |
0.126 |
0.198 |
0.338 |
0.368(X1) |
0.434(X2) |
畫菌數圖 & 算 D值 :
以最後兩次的數值來算,較穏定
總生菌數測定
<實驗器材&材料>
電子天平 /無菌試管/無菌水 /接種針/牛角麵包
<實驗步驟>
1.先取一小塊牛角麵包至 90 mL無菌水中先攪勻
2.使用無菌吸管吸取 10 mL 之水樣至 90 mL 之無菌稀釋液中
形成 10 倍稀釋度之水樣,混合均勻,
自 10 倍稀釋度水樣以相同操作方式進行一系列適當之
100、1000、10000 倍等稀釋水樣並混搖均勻
取107、106、105、104、103、102
2.取 0.2ml的原液及103、104稀釋度水樣滴在培養基的正中央塗盤,
將無菌之彎曲玻棒放在培養基上,
再用手旋轉培養皿至水樣均勻分佈於培養基表面、
完全被培養基吸收為止
(原液及各稀釋度水樣均需更換無菌之彎曲玻棒)。
3.置培養皿於培養箱內,在 35 ± 1℃ 培養 48 ± 3 小時
4.計數各稀釋度培養皿中所產生的菌落數並記錄之,
若菌落太多造成計數困難,
則以「菌落太多無法計數」(Too numerous to count; TNTC)表示。
但若各稀釋度培養皿之菌落數均超過 300 個,
則不可記錄「菌落太多無法計數」,
應選取最接近 300 個菌落數之
同一稀釋度的兩個培養皿進行菌落計數。
為什麼進行平板計數法時,
我們以 0.2mL菌液進行塗抹,而不直接採 1mL進行試驗?
因為若以 1mL觀察,菌數會太龐大,
或有菌種太接近重疊已形成菌落影響了計算,
因此才以 0.2mL的菌液下去塗抹。
電動天平
秤取培養基各成分及緩衝液等所需藥品之用
先記錄重量 (我們這組是用牛角麵包)
先取 900ml的無菌水至滴管與牛角先攪勻
使用無菌吸管吸取 10 mL 之水樣至 90 mL 之無菌稀釋液中
形成 10 倍稀釋度之水樣,混合均勻,
自 10 倍稀釋度水樣以相同操作方式進行一系列適當之
100、1000、10000 倍等稀釋水樣並混搖均勻
(進行稀釋步驟時,均需更換無菌吸管)
取107、106、105、104、103、102
取 0.2ml的原液及 103、104 稀釋度水樣滴在培養基的正中央塗盤,
將無菌之彎曲玻棒放在培養基上,
再用手旋轉培養皿至水樣均勻分佈於培養基表面、
完全被培養基吸收為止。
(原液及各稀釋度水樣均需更換無菌之彎曲玻棒)
置培養皿於培養箱內,在 35 ± 1℃ 培養 48 ± 3 小時
計數各稀釋度培養皿中所產生的菌落數並記錄之~
l 養牛樟芝 (課外)
材料:
燕麥粉/ 洋菜/ 二砂/ 大豆蛋白
實驗後:
影響細菌生長有物理因子及化學因子。
主要的物理因子有
生長溫度、酸鹼度 (pH 值)及膨壓 (osmotic pressure),
膨壓有時亦可考慮是化學因子之一。
細菌因生長溫度可分為
嗜冷生物 (psychrophile,-10- 20℃)、
嗜低溫生物 (psychrotrophs,0- 30℃)
嗜中溫生物 (mesophiles,20- 55℃)、
嗜熱生物 (thermophile,40- 70℃) 、
嗜高熱生物 (hyperthermophiles,65- 110℃)
不同細菌在不同溫度的生長情形也不同。
大多數細菌都生長在接近中性的 pH 值,
也就是在 pH 6.5 -7.5 間,
而黴菌 (mold)及酵母菌 (yeast)正常生長 pH 值較細菌為低,
也就是在 pH 5-6;
在鹼性狀態下會抑制微生物生長,
但在保存食物時,並不會將食物保在鹼性狀態下。
有些細菌能生長在 pH 值小於 4 的環境,
這種生物稱為嗜酸性生物 (acidophiles)。
微生物從環境中的水溶液中獲取它們主要的營養物質,
因此需依賴水生長,而她們身體中約 80-90%是由水組成,
因此若失去水會使生物失去正常功能。
若外界環境中膨壓較低 (如鹽類離子濃度較低),
細胞會吸收水而膨脹破裂；
若外界膨壓太高 (如鹽類離子濃度太高),
細胞會脫水而萎縮,此現象稱為原形質溶解。
而不同種類微生物可生長在不同鹽類濃度,
如極端嗜鹽生物 (extreme halophiles) 有時生長在 30%鹽類環境下。
有微生物是兼性嗜鹽生物 (facultative halophiles)
可生長在最高 2%鹽類環境。
影響微生物生長的化學因子
有碳 (carbon)、氮 (nitrogen)、硫 (sulfur)及磷 (phosphorus),
這些化學元素是構成糖類、和酸及蛋白質主要成份。
而因大氣中含有約 20%氧氣,而氧氣在水中溶解度不高,
而且溫度愈高,氧的溶解度愈低。
因此細菌會可分為
需氧氣才能生長的絕對好氧菌 (obligate aerobes)、
在有氧及無氧狀態下都能生長的兼性厭氧菌 (facultative anaerobes)
及在無氧狀態下才能生長的絕對厭氧菌 (obligate anaerobes)。
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