微生物生長曲線 &

連續稀釋塗抹平板法 & 總生菌數測定

 

 

<實驗目的>

 

1. 學習分光光度計的測定原理和實驗步驟 

2. 瞭解微生物生長曲線的四個時期所代表的意義 

3. 了解微生物生長情形,生理特性與培養特徵 

4. 細菌在培養液中生長速率及生長曲線繪製及計算 

 


<細菌生長曲線>  

 

以菌數和時間作圖在批次培養情形下,

可以菌數和時間作圖,得生長曲線。 

微生物在封閉的環境中的生長情形,

隨著營養物的消耗、 代謝物的產生等交互作用,

微生物的族群密度隨時間所呈現出來的曲線,

就是微生物的生長曲線。

 

受到外界環境因子生長,細菌數目增倍所需的時間不同,  

且因菌種不同而有差別,  

因此計算研究細菌生理作用或細菌與其他生物作用時, 

常需使用定量的細菌數,因此必須明白每個菌株的生長速率,  

而繪製及計算兩生長曲線: 

 

時間與細菌數目的生長曲線

吸光值 (OD)與細菌數目的生長曲線。  

進而利用吸光值與時間的生長曲線是否成直線相關,  

作為評估實驗的誤差。 

 

細菌在培養液中生長情形可分四種時期:

(1)遲滯期 (lag phase)

當細菌加入新的營養液中,為適應新環境要表現新的基因,

以便從環境中獲得營養成分進行複製,細胞雖變大,

但仍未分裂, 故細胞數目無明顯增加;

在這階段細菌數目並未增加,所以稱為遲滯期。

(2)對數期 (logarithmic phase)

細胞呈幾何級數增加,菌之生理較一致,

為微生物實驗最佳時期。

(3)靜止期或穏定期 (stationary phase)

    當環境中養分因細菌攝取而減少,

    微生物代謝,消耗養分、同時產生代謝毒物,

    造成新分裂與死亡之菌數約略相等,

    使得細菌無法進行正常複製,

    同時也改變基因的表現,細菌數目不再增加,

    此階段稱為靜止期。 

(4)減數期或死滅期 (reduction phase)

    養分已漸消耗完畢,而代謝毒物累積更多,

    細菌逐漸老化而死亡時,活細菌數目逐漸降低,

    造成新生菌數遠小於死亡菌數,時間愈久活菌數目愈少,

    因此菌數遞減,此階段稱為減數期。

 

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而測定細菌的生長區線主要有:

直接計數法、平板計數法、混濁度計算法。

 

直接計數法:由顯微鏡下計算細菌數。

平板計數法:將菌液連續稀釋,將稀釋後的各個濃度菌液取一定量

 塗抹在平板培養基上培養,計算培養基上的菌落數,

 來推算原菌液的細菌數。

混濁度計算法:利用分光光度計,

                        波長 590-600 nm 的可見光來測量菌液的混濁度,

                        通常以 OD 600來測量。

                        OD 600超過 0.9 以上時,將菌液稀釋 10 倍後再測定,

                        值需乘以 10 才是正確的混濁度。 

 


實驗 一 :

微生物生長曲線

 

<試劑及材料>

維生素C培養液 /大腸桿菌Escherichia Coli

 

<實驗步驟>

1.取少許大腸桿菌與培養液搖均勻

2.取部份菌液加入比色管 (1cc),用分光光度計測其吸光質

3.將菌液瓶放在 37℃的培養箱振盪培養,

   每 30分測一次吸收,共測四次

 

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先以維生素 C 培養液當 blank

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取 0.3cc大腸桿菌液與至10cc的培養液試管中

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加完後搖均勻

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取部份菌液加入比色管 (1cc),用分光光度計測其吸光值

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蓋子蓋起來更準確

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先按 blank 歸零 

開啟分光光度計 →加入定量菌玻璃測管

→將玻璃測管至於測量位置 →紀錄 OD 600數值 

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第一次 ( 0分鐘) 吸光值為 0.126 (以第一次為 blank)


水浴振盪器 (Water Bath Shaker) 

以水浴保持溫度恆定, 

再加上振盪裝置,用於需氧菌之液體培養 

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將菌液瓶放在 37℃的培養箱振盪培養,

30分鐘取出瓶子,測其吸光值

(取部份菌液30分測一次吸收,共測四次)

之所以放在 37℃的培養箱中,

是因為它為大腸桿菌的適合溫度!

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每次測之前先用 blank 歸零,

將放在振盪培養箱的菌液瓶取出,取部份菌份,測其吸光值 

第二次 (30吸光值為 0.198

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第三次 (60分) 吸光值為 0.338

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第四次 (90分) 吸光值為 0.368

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第五次 (120分) 吸光值為 0.434

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<實驗果>

時間與吸光值紀錄表: 

時間(分鐘

0

30

60

90(T1)

120(T2)

吸光度值

0.126

0.198

0.338

0.368(X1)

0.434(X2)

 

畫菌數圖 & 算 D值 :

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以最後兩次的數值來算,較穏定 


 總生菌數測定 

<實驗器材&材料>

電子天 /無菌試管/無菌水 /接種針/牛角麵包

 

<實驗步驟>

1.先取一小塊牛角麵包至 90 mL無菌水中先攪勻

2.使用無菌吸管吸取 10 mL 之水樣至 90 mL 之無菌稀釋液中

形成 10 倍稀釋度之水樣,混合均勻,

10 倍稀釋度水樣以相同操作方式進行一系列適當之

100100010000 倍等稀釋水樣並混搖均勻

取107、106、105、104、103、102

2.取 0.2ml的原液及103、104稀釋度水樣滴在培養基的正中央塗盤,

將無菌之彎曲玻棒放在培養基上,

再用手旋轉培養皿至水樣均勻分佈於培養基表面、

完全被培養基吸收為止

(原液及各稀釋度水樣均需更換無菌之彎曲玻棒)。

3.置培養皿於培養箱內,在 35 ± 1培養 48 ± 3 小時

4.計數各稀釋度培養皿中所產生的菌落數並記錄之,

若菌落太多造成計數困難,

則以「菌落太多無法計數」(Too numerous to count; TNTC)表示。

但若各稀釋度培養皿之菌落數均超過 300 個,

則不可記錄「菌落太多無法計數」,

應選取最接近 300 個菌落數之

同一稀釋度的兩個培養皿進行菌落計數。

 

為什麼進行平板計數法時,

我們以 0.2mL菌液進行塗抹,而不直接採 1mL進行試驗?

因為若以 1mL觀察,菌數會太龐大,

或有菌種太接近重疊已形成菌落影響了計算,

因此才以 0.2mL的菌液下去塗抹。 

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電動天平

秤取培養基各成分及緩衝液等所需藥品之用

先記錄重量 (我們這組是用牛角麵包) 

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先取 900ml的無菌水至滴管與牛角先攪勻

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使用無菌吸管吸取 10 mL 之水樣至 90 mL 之無菌稀釋液中

形成 10 倍稀釋度之水樣,混合均勻,

10 倍稀釋度水樣以相同操作方式進行一系列適當之

100100010000 倍等稀釋水樣並混搖均勻

(進行稀釋步驟時,均需更換無菌吸管)

107106105104103102 

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0.2ml的原液及 103104 稀釋度水樣滴在培養基的正中央塗盤,

將無菌之彎曲玻棒放在培養基上,

再用手旋轉培養皿至水樣均勻分佈於培養基表面、

完全被培養基吸收為止。

(原液及各稀釋度水樣均需更換無菌之彎曲玻棒) 

 


置培養皿於培養箱內,在 35 ± 1培養 48 ± 3 小時

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計數各稀釋度培養皿中所產生的菌落數並記錄之~ 


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l  牛樟芝 (課外)

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材料:

燕麥粉/ 洋菜/ 二砂/ 大豆蛋白

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實驗後:

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影響細菌生長有物理因子及化學因子。

主要的物理因子有

生長溫度、酸鹼度 (pH )及膨壓 (osmotic pressure),

膨壓有時亦可考慮是化學因子之一。

細菌因生長溫度可分為

嗜冷生物 (psychrophile,-10- 20℃)

嗜低溫生物 (psychrotrophs,0- 30℃)

嗜中溫生物 (mesophiles,20- 55℃)

嗜熱生物 (thermophile,40- 70℃)

嗜高熱生物 (hyperthermophiles,65- 110℃)

不同細菌在不同溫度的生長情形也不同。

 

大多數細菌都生長在接近中性的 pH ,

也就是在 pH 6.5 -7.5 ,

而黴菌 (mold)及酵母菌 (yeast)正常生長 pH 值較細菌為低,

也就是在 pH 5-6;

在鹼性狀態下會抑制微生物生長,

但在保存食物時,並不會將食物保在鹼性狀態下。

有些細菌能生長在 pH 值小於 4 的環境,

這種生物稱為嗜酸性生物 (acidophiles)

微生物從環境中的水溶液中獲取它們主要的營養物質,

因此需依賴水生長,而她們身體中約 80-90%是由水組成,

因此若失去水會使生物失去正常功能。

若外界環境中膨壓較低 (如鹽類離子濃度較低),

細胞會吸收水而膨脹破裂;

若外界膨壓太高 (如鹽類離子濃度太高),

細胞會脫水而萎縮,此現象稱為原形質溶解。

 

而不同種類微生物可生長在不同鹽類濃度,

如極端嗜鹽生物 (extreme halophiles) 有時生長在 30%鹽類環境下。

有微生物是兼性嗜鹽生物 (facultative halophiles)

可生長在最高 2%鹽類環境。

影響微生物生長的化學因子

有碳 (carbon)、氮 (nitrogen)、硫 (sulfur)及磷 (phosphorus),

這些化學元素是構成糖類、和酸及蛋白質主要成份。

而因大氣中含有約 20%氧氣,而氧氣在水中溶解度不高,

而且溫度愈高,氧的溶解度愈低。

因此細菌會可分為

需氧氣才能生長的絕對好氧菌 (obligate aerobes)

在有氧及無氧狀態下都能生長的兼性厭氧菌 (facultative anaerobes)

及在無氧狀態下才能生長的絕對厭氧菌 (obligate anaerobes) 

 

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