天空藍早食 & Jessie's 烘焙工作室

乳酸菌培養基之備製與乳酸菌培養 & 革蘭氏染色

實驗:   

- 乳酸菌培養基之備製與乳酸菌培養

- 革蘭氏染色-乳酸菌觀察

- 石蕊牛奶分析

<實驗目的>

乳酸菌培養&乳酸菌觀察

<認識乳酸菌>

乳酸菌」是指能夠代謝糖類、產生 50%以上乳酸之細菌,

具有這些功能的細菌包括了:

乳酸桿菌 (Lactobacillus)、

鍵球菌 (Streptococcus)、念球菌 (Leuconostoc)等,

乳酸菌存活於酸性環境中,

不過如果太酸, pH值 < 3 則反而不利乳酸菌生長。

乳酸菌對營養需求特別嚴苛,除了作為能源之糖類外,

乳酸菌需要各種各樣的

氨基酸、維生素、礦物質等,以維持其生長。  

<菌名>

Lactobacillus brevis

<分類>

Lactobacillus brevis是 Lactobacillaceae科,Lactobacillus屬,

共有三十五種。

一般利用醣類發酵生成乳酸的細菌,總稱為乳酸菌，

以Streptococcus、Pediococcus、Leuconostoc、

Lactobacillus、Bifidobacterium 這幾屬較為重要。

Lactobacillus brevis中的 brevis是形容詞,意指短的。

<自然棲息地>

可存於牛奶、起司、sauerkraut (酸醃菜,一種德國泡菜)、

酸奶油、乾的牛糞、人或鼠類的嘴巴和腸道中。

<大小型態>

圓形短桿狀,菌體長度約 2－4μm,直徑約 0.7－1.0μm,

大部分是單獨存在或成短鏈狀,不生孢子,為 Gram positive,

無鞭毛,無運動性之通性厭氧菌,

若乳酸菌會運動則是利用鞭毛,但並不常見。

<適合生長環境>

乳酸菌適合的生長溫度 2-53℃,

最佳的生長溫度 30-40℃,

Lactobacillus brevis在 45℃以上不生長。

乳酸菌會產生大量的酸,

故適合生長於微酸的環境中,最適宜的 pH 5.5-6.2,　 

而有些乳酸菌甚至於 pH 5.0以下也可以生長。

<培養特性> 

乳酸菌是一種對營養十分挑剔的菌,

需用複雜培養基來培養, 

例如異質乳酸菌需要維他命B1, 

且對營養的需求可大略當成每一種乳酸菌的特徵, 

而 Lactobacillus brevis需存在於

維他命 B1、B3、B5、B皆有的環境下； 

維他命 B6、B12則不需要。 

<生化特性> 

乳酸菌還原硝酸鹽的情況,只發生在較特殊的情況下, 

如 pH = 6.0的情況下, 

而 Lactobacillus brevis不還原硝酸鹽

且 Lactobacillus brevis不液化動物膠, 

即不分解酪蛋白, 可依乳酸菌發酵的型式,
區分為同型(homo)乳酸菌和異型 (hetero)乳酸菌, 

其中同型即指一分子葡萄糖發酵產生二分子乳糖, 

而異型則是從一分子葡萄糖產生乳糖外, 

另外副產生乙醇、醋酸、甘油及二氧化碳 

(乳酸製造工業多以同型乳酸桿菌為主)； 

Lactobacillus brevis 為異型乳酸菌。

<致病性及應用> 

各國研究報告指出- 

乳酸菌能抑制腸道致病菌

(ex：Escherichia coli、Klebsiella pneumoniae )  

於維持消化道機能,促進食慾； 

並對免疫力的調節及人體營養素的吸收,有非常正面的幫助。 

優酪乳中富含乳酸菌,而優酪乳有許多已被證明的效益,

包括 

(１)改變牛奶的成份,增加牛奶的營養價值 

(２)避免乳糖不耐症及牛奶過敏症 

(３)對抗致病菌 

(４)強化免疫系統 

(５)抗癌 

(６)降低膽固醇，預防心臟病及腦血管意外 

(７)含活性Ｂ群維他命可供人體使用。

乳酸菌可製造 Ｂ群維他命以供給宿主使用, 

以維持人體許多重要器官系統的功能, 

前面所提優酪乳的功能,

可能有部份來自優酪乳所含的 Ｂ群維他命。 

飲用優酪乳後,乳酸菌會與葡萄球菌、大腸桿菌等菌種

競爭營養及附著位置, 使這些致病菌則不易在腸道生存。 

此外,乳酸菌可自行產生天然的抗生素, 

其中 Lactobacillus brevis可製造 Lactobacillin及 Lactobrevin。 

另外在 1890 年美國已應用乳酸菌,

使其產酸及增加風味,而有專利的乳製品。 

Jensen and Paddock ( 1940 )

已開始研究利用乳酸桿菌製造乾香腸, 

據稱乳酸菌在發酵香腸的製造上可縮短熟成時間, 

防止缺陷製品及改善風味與質地。 

/ 石蕊牛奶分析 

牛奶中主要含有乳糖和酪蛋白, 

在牛奶中加入石蕊是作為 

酸鹼指示劑和氧化還原指示劑。 

石蕊在中性時呈淡紫色,酸性時呈粉红色,鹼性呈藍色, 

還原時則自上而下地褪色變白。

<石蕊牛奶試驗> 

包含乳酸醱酵、產氣、石蕊反應、乳凝塊形成、

蛋白分解、鹼反應等反應 ……

-乳酸醱酵 

許多微生物能利用乳糖作為碳源,

當乳糖經 b-galactosidase作用後產生葡萄糖及半乳糖,

經 Embden-Meyerhof路徑變成 Pyruvic acid再轉變成乳酸,

藉由石蕊偵測,由於石蕊在中性時是紫色,

在近 pH 4時,其顏色為粉紅色,

若當乳酸形成,溶液會變成粉紅色。

-產氣 

微生物的醱酵過程中會產生 CO₂、H₂,

若有氣體產生可以觀察得知。

-石蕊反應 

一種氧化還原指示劑,

醱酵過程石蕊就像一個氫離子的接受者。

當時石蕊為氧化態時,則是紫色；

若在還原態時 (接受了氫離子),則會被還原成白色。

-乳凝塊 

乃因蛋白質變性導致培養基凝集的現象。

-蛋白質分解

某些微生物藉由蛋白酶的作用來獲得其能量,

因此使得培養基中大分子蛋白質斷裂,而使液體變透明。

-鹼反應 

具有分解蛋白質能力之細菌,

將酪蛋白分解成較小胜肽鏈,而產生鹼性的終產物,

使得培養基變成藍色。 

<步驟> 

1.將菌接於含有 litmus milk的培養液中。 

2.37^oC下, 24小時,觀察液體的顏色,以及培養液的黏稠度。 

/ 塗抺平板法

在一旁的助教看我一直在拍照做記錄,

而我們因為都是第一次倒都有點怕怕的,

所以就示範一下他的手法-

左手拿著蓋子,右手拿著洋菜液快速倒入培養皿中(速度太慢會硬掉),

蓋上蓋子晃一下讓洋菜液平均即可!

/ 乳酸菌培養基之製備與乳酸菌培養

< 養樂多 & AB優酪乳 > 

/ 革蘭氏染色- 乳酸菌觀察 

革蘭氏染色法是 1884 年

由丹麥病理學家 C.Gram 所創立的。 

革蘭氏染色法可將所有的細菌區分為 

革蘭氏陽性菌 (G+)和

革蘭氏陰性菌 (G—)兩大類, 

是細菌學上最常用的鑒別染色法。 

該染色法所以能將細菌分為 G+菌和 G—菌, 

是由這兩類菌的細胞壁結構和成分的不同所決定的。 

G—菌的細胞壁中含有較多易被乙醇溶解的類脂質,

而且肽聚糖層較薄、交聯度低，

故用乙醇或丙酮脫色時溶解了類脂質, 

增加了細胞壁的通透性,

使初染的結晶紫和碘的複合物易於滲出, 

結果細菌就被脫色,再經蕃紅複染後就成紅色。 

G+菌細胞壁中肽聚糖層厚且交聯度高,類脂質含量少,

經脫色劑處理後反而使肽聚糖層的孔徑縮小,

通透性降低,因此細菌仍保留初染時的顏色。

<實驗材料> 

1、市售養樂多 & AB優酪乳。 

2、染色液和試劑：甲烯藍 、碘液、酒精、蕃紅、油鏡油。 

3、器材：載玻片、酒精燈、拭鏡紙、顯微鏡。

<實驗步驟>

(1) 塗片：

取潔凈無油污的載玻片一塊,

用牙簽取一滴養樂多 / AB優酪乳, 滴於玻片中心,

在養樂多 / AB優酪乳上加一小滴蒸餾水,

將之塗開為均勻薄層

(2) 乾燥：

讓塗片自然氣乾或將塗面朝上,

在酒精燈上高處溫火烘乾,使水分蒸發

(3) 固定：

手執玻片一端 將已乾燥的塗片,

在酒精燈火焰外層盡快的來回通過 2-3次,

殺死微生物,固定細胞結構便於染色。

待玻片冷卻後再加染色液。

(4) 染色：

(常用的鹼劑有甲烯藍、結晶紫、石炭酸複紅)

將塗片置於水平位置上,在整個塗面上滴甲烯藍染色液,

染色 1min左右

(通常染色時間的長短取決於菌體、染色液的種類和它的濃度)。

(5) 水洗:

染色時間一到,將玻片反過來,

用水細流沖洗塗片,洗至流下的水中無染料顏色為止。

(6)媒染：

滴加碘液,媒染 1min。

(7)水洗：

用水洗去碘液。

(8)脫色：

將玻片傾斜,連續滴加 95%酒精

脫色 30秒至流出液無色,立即水洗。

(9)複染：

滴加蕃紅複染 5min。

(10)水洗：

用水洗去塗片上的蕃紅染色液。

(11) 乾燥：

在空氣中自然乾燥,也可用吸水紙吸去載玻片上的水,

但應注意不能將濾紙在涂面上拖擦;

或者也可用酒精燈烘乾,較快。

(12)鏡檢：

鏡檢時先用低倍,再用高倍,最後用油鏡觀察,

並判斷菌體的革蘭氏染色反應性。 

<實驗後的處理>

將浸過油的鏡頭-

a.先用擦鏡紙將油鏡頭上的油擦去。

b.用擦鏡紙沾少許二甲苯將鏡頭擦 2-3 次。

c.再用乾淨的擦鏡紙將鏡頭擦 2-3 次。

注意擦鏡頭時向一個方向擦拭。