酵母菌培養 & 簡單染色
/ 酵母菌培養基之製備與酵母菌培養
將 "接種環-Loop" 在火焰上灼燒滅菌
(太熱也不行- 會把酵母菌給燙死)
在洋菜培養基上 "劃線"
第一次接觸,所以下手太重了
/ 簡單染色- 酵母菌觀察
微生物染色技術的一般過程如下：
塗片→乾燥→ 固定→ 染色→媒染
→脫色→復染→水洗→乾燥→鏡檢
取潔凈無油污的載玻片一塊 (有正反面)
用無菌牙簽取一滴已稀釋的酵母液
將酵母液滴於玻片中心
在酵母液上加一小滴蒸餾水
將之塗開為均勻薄層,這樣要乾燥時也比較快
(用過的牙簽的立即投入廢物桶)
乾燥：
讓塗片自然氣乾或將塗面朝上,
在酒精燈上高處溫火烘乾,使水分蒸發,
但切勿緊靠火焰或加熱時間過長,以防標本烤焦而變形。
重複剛剛的動作 -
抺開→乾燥 (直到把水份乾燥)
固定：
將已乾燥的塗片 (塗面朝上),
在酒精燈火焰外層盡快的來回通過 2-3次,
殺死微生物,固定細胞結構便於染色。
待玻片冷卻後再加染色液。
熱固定可避免染色時,細胞被沖走,
是因細胞的蛋白質因熱凝固而固定在玻片表面
染色：
(常用的鹼劑有甲烯藍、結晶紫、石炭酸複紅)
將塗片置於水平位置上,
在整個塗面上滴甲烯藍或結晶紫染色液,染色 1min左右
(通常染色時間的長短取決於菌體、染色液的種類和它的濃度)。
染完色後要等 1min左右,再沖水
水洗:
染色時間一到,將玻片反過來,
用水細流沖洗塗片,洗至流下的水中無染料顏色為止
乾燥：
在空氣中自然乾燥,也可用吸水紙吸去載玻片上的水,
但應注意不能將濾紙在涂面上拖擦;
或者也可用酒精燈烘乾,較快。
用顯微鏡看試片
(天啊~ 距離上次用顯微鏡,
應該是幾百年前的事了吧 ........ 哈哈)
鏡檢：
乾燥後的載片標本可用顯微鏡觀察-
先低倍顯微鏡觀察 10X(目鏡) 40X(物鏡);
找出適當的視野後,將高倍鏡轉出,在玻片上加油鏡油一滴,
再高倍觀察 10X(目鏡) 100X(物鏡) 細菌的形態。
酵母細胞觀察
實驗報告
實驗:
/ 酵母菌培養基之製備與酵母菌培養
/ 簡單染色-酵母菌觀察
<實驗目的>
觀察細菌細胞外型與排列情況
<原理>
染色是觀察微生物的一種重要方法。
由於微生物細胞含有大量水分,
一般在 80%-90％以上,
對光線的吸收和反射與水溶液的差別不大,
與周圍背景沒有明顯的明暗差。
所以,除了觀察活體微生物細胞的運動性
和直接計算菌數外,
絕大多數情況下都必須經過染色後,
才能在顯微鏡下進行觀察。
染色和染色劑的原理
微生物染色的基本原理,
是借助物理因素和化學因素的作用而進行的。
物理因素如細胞及細胞物質對染料的
毛細現象、滲透、吸附作用等。
用肉眼是看不見微生物的,
因其小、透明、無色,最好以顯微鏡來觀察學習。
染劑 (stain or dye)是種有機化合物,
當前普遍採用的染色劑是含有苯環的有機化合物,
染料分子都由苯環、
連接在苯環上的染色基團 (或稱呈色基團,色基)
和助色基因 (或稱作用基團)三部分組成、
助色基團具有電離特性,
電離後帶有正或負電荷的染料離子
便能與細胞有較牢固地結合,使其呈現顏色。
成分上是
苯環加上彩色化學基 (chromophore)
及輔助彩色物 (auxochrome) 。
chromophore是化學 group給予苯環色彩;
auxochrome是傳達色彩,附著在物體上。
染料可按其電離後染料離子所帶電荷的性質分為
酸性染料、鹼性染料、中性(復合)染料和單純染料四大類。
染劑是否能附著在大分子上,需看彼此電價情況。
酸性染劑,
本身是負電之彩色基,對細胞的正價離子部分,
有強烈的接受性,而賦予細胞顔色。
當細菌分解糖類產酸使培養基 pH 下降時,
細菌所帶正電荷增加,
因此易被伊紅、酸性複紅或剛果紅等酸性染料著色。
鹼性染料的離子帶正電荷,
能和帶負電荷的物質結合。
因細菌蛋白質等電點較低 (pH值大約在 2-5之間),
當它生長於中性、鹼性或弱酸性的溶液中時常帶負電荷,
因此,帶負電荷的細菌常和帶正電荷的鹼性染料進行結合,
所以在細菌學實驗室中常用鹼性染料進行染色。
中性染料是前兩者的結合物又稱複合染料,
如伊紅美藍、伊紅天青等。
以鹼性染劑效果較好,
因為細菌之核甘酸及部分細胞壁組成帶有負電荷,
可吸住正電的彩色染劑。
常用的鹼劑有
甲烯藍 (methylene blue)、結晶紫(crystal violet)、
石炭酸複紅(carbol fuchsin)
染色所需時間:
甲烯藍 1-2min、結晶紫 2-6sec、石炭酸複紅 15-30sec
1 酸性染料
這類染料電離後染料離子帶負電荷、
如酸性復紅、剛果紅、伊紅、藻紅、苯胺黑等,
可與鹼性物質結合成鹽。
2鹼性染料
這類染料電離後染料離子帶正電荷、可與酸性物質結合成鹽。
微生物實驗室一般常用的鹼性染料有
鹼性復紅、中性紅、孔雀綠、番紅、結晶紫、美蘭、甲基紫等,
在一般的情況下,細菌易被鹼性染料染色。
3中性 (復合)染料
酸性染料與鹼性的結合物叫做中性(復合)染料,
如伊紅、美蘭等，瑞脫氏 (Wright)染料
和基姆薩氏 (Gimasa)染料等,
後者常用於細胞核的染色。
4單純染料
這類染料的化學親和力低,不能和被染的物質生成鹽,
其染色能力視其是否溶於被染物而定,
因為它們大多數都屬於偶氮化合物,
不溶于水,但溶於脂肪溶劑中,
如蘇丹類 (Sudan b)的染料。
細菌染色的方法
染色的方法一般分為
單染色法 (又稱一般染色法)
和復染色法 (又稱特殊染色法)兩種。
簡單染色法是只用一種染料使細菌著色以顯示其形態,
以便觀察微生物的大小、形狀和細胞排列狀況,
但不能辨別微生物以及它的構造。
復染色法是用兩種或兩種以上染色液進行染色,
有協助鑒別微生物的作用,故也稱鑒別染色法。
常用的復染色法有
革蘭氏染色法和抗酸性染色法,
還有鑒別細胞各部結構的
如芽孢子染色法、莢膜染色法、鞭毛染色法、
細胞核染色法等的特殊染色法。
<以功能性區分>
(1) simple stain:
使用單一染劑,來觀察細菌的外觀與排列,
如成對、四體、鏈狀、團塊。
(2) differential stain:
使用兩種或以上的不同染劑,又可細分為兩類-
1.區分細菌為不同 group: Gram stain、Acid-fast stain
2.看見細胞結構:
Flagella stain、Capsule stain、Spore stain、Nuclear stain
<任何一項抺片染色基本技巧>
1.玻片
先洗去油漬,再用 95%酒精濕潤過一次,拭鏡紙擦乾
2.抺片
取細菌樣品避免太厚,薄薄一層即可
a.取用液體微生物:
均勻抺開一至二環細胞,成一個硬幣狀
b.取用固體微生物:
先用一環水和細胞稀釋,從中取一環到玻片,均勻塗開,風乾
3.熱固定:
可避免染色時,細胞被沖走,
是因細胞的蛋白質因熱凝固而固定在玻片表面
<實驗材料>
1. 塗片染色用的細菌培養物
麵包酵母培養液
釀酒酵母培養液
2. 甲烯藍 (methylene blue)、結晶紫 (crystal violet)
用 150ml燒杯 2個各裝 50ml-- simple stain用
3. 乾淨載玻片2片、接種環1支、酒精燈1盞、拭鏡紙、無菌牙簽
4. 顯微鏡、油鏡油、各種染色液
微生物染色技術的一般過程如下：
塗片→乾燥→ 固定→ 染色→媒染
→脫色→復染→水洗→乾燥→鏡檢
simple stain簡單染色：
(1) 塗片：
取潔凈無油污的載玻片一塊,
用無菌牙簽取一滴已稀釋的酵母液, 滴於玻片中心,
在酵母液上加一小滴蒸餾水,將之塗開為均勻薄層
(用過的牙簽的立即投入廢物桶)
(2) 乾燥：
讓塗片自然氣乾或將塗面朝上,
在酒精燈上高處溫火烘乾,使水分蒸發,
但切勿緊靠火焰或加熱時間過長,以防標本烤焦而變形。
(3) 固定：
手執玻片一端 (菌膜/塗面 朝上)將已乾燥的塗片,
在酒精燈火焰外層盡快的來回通過 2-3次,
殺死微生物,固定細胞結構便於染色。
待玻片冷卻後再加染色液。
(4) 染色：
(常用的鹼劑有甲烯藍、結晶紫、石炭酸複紅)
將塗片置於水平位置上,
在整個塗面上滴甲烯藍或結晶紫染色液,染色 1min左右
(通常染色時間的長短取決於菌體、染色液的種類和它的濃度)。
(5) 水洗:
染色時間一到,將玻片反過來,
用水細流沖洗塗片,洗至流下的水中無染料顏色為止。
(6) 乾燥：
在空氣中自然乾燥,也可用吸水紙吸去載玻片上的水,
但應注意不能將濾紙在涂面上拖擦;
或者也可用酒精燈烘乾,較快。
(7) 鏡檢：
乾燥後的載片標本可用顯微鏡觀察-
先低倍顯微鏡觀察 10X(目鏡) 40X(物鏡);
找出適當的視野後,將高倍鏡轉出,
在玻片上加油鏡油一滴,
再高倍觀察 10X(目鏡) 100X(物鏡) 細菌的形態。
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